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Grande importanza ha per Leonardo il rapporto tra scienza e arte: partendo, infatti, da una concezione ancora quattrocentesca, fa della produzione artistica lo specchio della natura, la quale deve essere studiata e indagata a fondo per essere degnamente rappresentata. Da qui la sua dedizione per gli studi di botanica, anatomia e in particolare ottica, dove l'occhio è considerato come tramite tra l'immagine e l'anima. Per Leonardo: "La pittura è composizione di luci e di tenebre insieme mista con le diverse qualità di tutti i suoi colori semplici e composti" (Trattato della Pittura). A partire da questo aspetto possono essere analizzati i suoi dipinti: con la tecnica dello sfumato, lo spazio acquista una profondità prospettica che egli stesso definisce "aerea", perché condizionata dal filtro dell'aria; luci ed ombre quindi si confondono portando ad un'armonia di forme e ad una perfezione che caratterizzeranno tutta la sua produzione artistica. La pittura di Leonardo è animata dalla preoccupazione del chiaroscuro piuttosto che da quella del colore.
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Ad ogni modo egli tratta il colore con grande perizia, ed anche su di esso anticipa delle leggi che solo la scienza e l'arte dei secoli posteriori riusciranno a codificare ed applicare. All'affresco Leonardo preferisce la tempera ma si sforza di solidificarla con nuovi glutini come nella celebre "Ultima Cena" del Convento di Santa Maria delle Grazie di Milano. Considerando gli attimi dopo che Gesù disse: "Uno di voi mi tradirà", Leonardo riesce ad esprimere nel volto dei dodici apostoli tutto lo stupore di quell'affermazione, a partire da Giuda che, appoggiandosi alla tavola con un gomito, fissa Gesù. Senz'altro uno dei capolavori più importanti di tutta la pittura è "la dama al balcone", che venne eseguita da Leonardo a Roma, sotto commissione di Giuliano de Medici, e di cui non abbiamo alcuno studio preparatorio. Celebrata da Vasari come ritratto di Monna Lisa Gherardini, moglie del fiorentino Francesco del Giocondo, la Gioconda si trova in una posizione elevata rispetto allo sfondo, costituito da un vasto paesaggio deserto, nel quale la donna si trova in perfetta armonia.

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Il fatto che soggetto e paesaggio siano un'unità totale sta ad indicare che l'uomo fa parte della natura senza urti né contrapposizioni. Il disegno conservato nella Biblioteca Reale di Torino e universalmente noto come l'autoritratto di Leonardo, è quello che più d'ogni altro ha influenzato l'immaginario comune su Leonardo: il vecchio genio con la folta barba bianca. In realtà i critici sono discordi sulla datazione del disegno e sul soggetto; un critico inglese, Robert Payne, ha suggerito che possa trattarsi di un ritratto del padre di Leonardo, mentre un critico tedesco ne ha addirittura messo in dubbio l'autenticità, attribuendolo ad un pittore ottocentesco, Giuseppe Bossi. La grande maggioranza dei critici è però propensa a ritenerlo effettivamente l'autoritratto di Leonardo, forse leggermente idealizzato rispetto alla realtà mentre permangono forti dubbi sulla datazione.
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